文章详情

琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项

日期:2020-05-17 04:10
浏览次数:22
摘要:实验室琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项

DNA分子带负电,从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动,速度依赖于其分子质量。

小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度,例如质量浓度3mg/ml的琼脂糖用来做DNA大片段电泳(>20 000碱基)而0.8%只能电泳小的片断。

  要注意以下几点:  1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul,因此吸取每一个样品时,操作要稳当且细心。  2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度,以使每个样品停留在各自的点样孔中。  3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料(如溴酚蓝),用以看出样品移动的距离。  4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品,电泳结束后,根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。  5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间,电泳槽盖要安全盖好,以防止液体蒸发,又可以降低电击的可能性。  6、 电泳结束后,将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭(EB)中,5min后即可看到DNA带,EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时,在胶中加入EB。  7、 在紫外灯下,由于EB发出强烈的橘红色的荧光,所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样,利用特制的照相机和调焦器,也可以对凝胶拍照。  8、 如果要对某一条带(如质粒)进一步分析,可用小刀将含该带的凝胶切割下来,从带中回收DNA。 


 其他注意事项:  1、 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。  2、 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。  3、 电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和pH,应常更新电泳缓冲液。  4、 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辩认不清;反之则应适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。  5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率


来源分享自互联网